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日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29kDa表膜蛋白疫苗免疫效应的研究

来源:华体会体育app   发布时间:2021-07-17 00:21nbsp;  点击量:

本文摘要:1前言 血吸虫病是由血吸虫引发的一种慢性寄生虫病。据世界卫生组织(WHO)2014年2月第115号报导,累计2012年,全球最少有2.49亿人必须获得血吸虫病化疗,获得血吸虫病化疗的报告人数为4210万[1]。我国另有454个血吸虫病风行县(市、区),共计风行村30701个,估算患者28万余例,全国现有钉螺面积372664.10hm2,其中新发现钉螺面积1163.87hm2[2]。

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1前言   血吸虫病是由血吸虫引发的一种慢性寄生虫病。据世界卫生组织(WHO)2014年2月第115号报导,累计2012年,全球最少有2.49亿人必须获得血吸虫病化疗,获得血吸虫病化疗的报告人数为4210万[1]。我国另有454个血吸虫病风行县(市、区),共计风行村30701个,估算患者28万余例,全国现有钉螺面积372664.10hm2,其中新发现钉螺面积1163.87hm2[2]。

目前,掌控日本血吸虫病的措施主要还是以灭亡螺和药物化疗居多,但依然不存在着诸多问题,比如:预防成本高、效果佳、环境污染、反复病毒感染、畜类病毒感染掌控艰难、血吸虫虫株的抗药性经常出现的潜在威胁等。在以往的流行病学调查中找到病毒感染血吸虫后的人群体内可以产生抵抗力,人体的免疫系统起着一定的维护起到,由此解释血吸虫在宿主体内引发了一定的保护性免疫反应,而血吸虫自身生活史的特点如宿主体内发育不交配,这为日后研究血吸虫病疫苗获取了很好的思路。   WHO专家Bergquist等认为,预防性疫苗分开用于或与化疗药物磁共振,为血吸虫病的可持续掌控获取了一条理想途径[3]。而未来血吸虫病预防策略将不会是:以疫苗接种诱导的具备长效的免疫预防起到补足掌控传播的短效严重不足[4]。

血吸虫病疫苗的研究早已半个多世纪了,随着生物学和免疫学技术的大大发展,疫苗的研究也经历了很多的变革,从减毒或灭活疫苗到目前的蛋白疫苗、基因工程疫苗等,科学家们仍然在不懈努力。在这个过程中,研究人员运用分子生物学和免疫学等方法对血吸虫病疫苗候选分子展开了大量实验研究,确认了一些疫苗候选分子,如谷胱甘肽S转移酶、磷酸丙糖异构酶、23kDa膜蛋白等[5]。但是以往研究指出,以小鼠作为模型,评价对谷胱甘肽S转移酶、磷酸丙糖异构酶等抗原免疫系统保护性效果仍过于理想。

余光明等在动物实验模型中,分别用Sj26和rSj26GST分开免疫系统小鼠,得减虫率28.0%和25.5%以及减卵亲率20.6%和33.0%[6]。所以找寻新的高效疫苗候选分子依然是今后疫苗研究的主要任务。

   血吸虫虫体与宿主免疫系统必要认识相互作用,体被是虫体的最外层结构,覆盖面积于整个虫体的表面。其体被参予一系列的生理过程:营养吸取、免疫系统躲避、消化新陈代谢产物、调节渗透压、感觉及信号转导等[6]。表格膜蛋白更加不易性刺激机体产生比较不应的免疫反应,提醒坐落于血吸虫体被的表格膜蛋白作为疫苗和药物靶点的重要性,故指出表膜涉及抗原研究在血吸虫病疫苗发展和免疫诊断方面起最重要起到[8]。

Braschi等根据可溶性的有所不同将体被蛋白分成胞浆内蛋白、细胞骨架蛋白和膜涉及蛋白。利用链亲和素亲和层析的方法,找到坐落于体被表面的蛋白仅有9种[9]。

依循可以利用蛋白组学和生物信息学技术检验出有更佳的血吸虫病疫苗候选分子,针对血吸虫表膜抗原分子,国内外不少专家展开很多研究。Cardoso等2006年找到在被血吸虫病毒感染的人群体内,检测到外用Sm29的抗体亚型IgG1和IgG3的水平很高,之后通过RT-PCR技术和生物信息学等手段确认了Sm29在曼氏血吸虫体内的一种跨膜分子,且需要较高传达[10]。

接着2008年Cardoso等学者们通过共计探讨显微镜确认Sm29蛋白为体表分子,通过动物模型实验,获得重组Sm29kDa蛋白51%减虫率、60%减半卵率和50%减半肉芽肿的结果[11]。四跨膜蛋白超家族(TM4SF)普遍传达于多种的组织、细胞,它归属于小分子量的糖蛋白,约有20多个成员[12]。Tran等通过信号序列捕捉技术找到了两个TSP家族成员—SmTsp1和SmTsp2,经免疫定位实验得出结论,TSP传达于血吸虫体被,研究人员将假设的耐受性者和感染者的血清展开ELISA检测,获知耐受性者的血清中外用TSP-2的抗体IgG1和IgG3水平,在动物实验中得出结论SmTSP2融合蛋白免疫系统小鼠后,获得了减虫率57%、肝脏减卵亲率64%和粪减卵亲率69%的结果[13]。

因此,TSP2蛋白被指出是潜在的保护性抗原。Yuan等研究人员扩充了一段SjTSP2膜外大环区,亚克隆至pET32a质粒中传达了Trx-TSP2融合蛋白,也得出结论56%的减虫率、53%的肝脏减半卵率和52%的粪减卵亲率结果[14]。   为了检验出有更佳地疫苗候选抗原分子,探究有所不同疫苗形式对免疫系统效果的影响。

本研究挑选日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团蛋白(SjTsp2)与Sj29kDa表格膜蛋白胞外区(Sj29),通过基因SOEingPCR技术,用疏水性多肽(Gly4)3作为相连肽将二者展开相连,建构的融合基因pet32a/SjTsp2/Sj29kDa传达质粒[6],在此基础上,本课题通过诱导传达,大量制取重组表格膜蛋白,研究其对小鼠外用血吸虫病的保护性免疫效果。血吸虫病是危害十分相当严重的一种人兽共计患上寄生虫病。近年来,在我国南方12个省的449个血吸虫风行县中,仍有90个县的疫情仍未获得掌控,将近50万人转化成为慢性血吸虫病人[15]。人类对人体血吸虫皆无先天性免疫,宿主病毒感染血吸虫后对再行病毒感染可产生有所不同程度的抵抗力,对再度侵略的童虫具备一定的破片起到,但对原发病毒感染的成虫是不起作用的。

现今用作血吸虫病化疗的药物效果较好的仅有吡喹酮,然而吡喹酮的起到机理是必要杀死血吸虫,对于日本血吸虫虫卵各期的发育却没显著的影响[16]。因此,有效地的血吸虫病疫苗的研究是目前有效地预防血吸虫病最重要措施之一。   血吸虫是一种多细胞生物,且生活史比较复杂,有所不同的发育阶段正处于有所不同的环境条件下,因此它的生理、生化和适当的的组织结构也随虫期的变化而不时地调整,有所不同虫期的新陈代谢产物也都随之变化,其中有些新陈代谢产物在有所不同的虫期中普遍存在,但有些新陈代谢产物具备种、株甚至虫期的特异性[17]。

这也要求了血吸虫病疫苗研究的可玩性。日本血吸虫疫苗研究有数80多年的历史,大体经历了死疫苗、减毒活疫苗、分子疫苗和DNA疫苗这几个研究阶段[18]。随着近年来,有许多学者在血吸虫分子疫苗领域做到了大量的研究,并获得了一些成果。

为了更佳的提升疫苗的效果,研究人员采行了很多创意手段,建构重组多价疫苗是其中的一种方法。单一基因重组的DNA疫苗唤起宿主免疫系统的不完全性等因素影响,单价DNA疫苗的维护效果仍不尽人意。与单一的疫苗比起,重组多价疫苗一般能取得较好的免疫系统效果,从而超过强化宿主外用血吸虫病毒感染诱导血吸虫病病程进展的效果[19]。

王素娟等[20]应用于PCR技术建构重组抗原rSj06868,取得31.63%的减虫率和55.63%的肝脏减卵亲率;刘秉春等[21]用日本血吸虫DNA疫苗VR1012-SjGST-32与重组蛋白疫苗rSjGST-32牵头免疫系统小鼠,取得42.3%的减虫率。郭凡吉等[22]利用生物信息学技术检验SjPGAM和SjEnol畜II类、鼠源(H2-d)II细胞融合表位且与宿主同源性较小的肽段,并展开拼凑,经传达后免疫系统小鼠,取得了39.7%的减虫率和64.9%的肝脏减卵亲率;朱路[23]运用RT-PCR和重组PCR技术建构三价DNA疫苗pVIVO2/SjFABP/Sj26.SjGAPDH,在小鼠外用血吸虫病毒感染中所致减虫率和减卵率为58.6%和59.8%。

以上血吸虫分子疫苗的研究中运用有所不同的方法建构了各种重组抗原,皆获得了一定的免疫系统维护效果。对于血吸虫自身来说,它本身具有类似的结构特征。血吸虫体被必要曝露于宿主血液及免疫系统下,参予虫体的营养新陈代谢、消化、免疫系统逃离现场和调节、渗入调节、感觉和信号转导,沦为疫苗研发的热点之一[6]。血吸虫虫体的表面抗原和消化-黏液抗原可必要认识或致敏宿主的免疫细胞,因此虫体的表面抗原尝试免疫系统效应反击的把抗原,而消化-黏液抗原经常具备酶的性质,转入血液沦为循环抗原,可所致宿主的保护性免疫,或构成抗原抗体复合物,引发免疫病理变化[17]。

早已有研究找到了一部分不存在于体被表面的蛋白以及通过体被运输的蛋白。主要还包括两种蛋白:胞内蛋白和膜融合蛋白,后者坐落于血吸虫体被表面[24-25]。近些年有学者通过免疫学技术等检验出有血吸虫虫体的表格膜蛋白,如:Mr23000膜蛋白、Mr29000膜蛋白、Mr20000膜蛋白、Mr7392膜蛋白、Mr4463膜蛋白、Mr921膜蛋白、Mr16000表面膜蛋白等[26]。针对这些膜蛋白,科学家们做到了很多研究,任建功等制取SjC23DNA疫苗和蛋白疫苗分别免疫系统小鼠,取得减虫率为26.9%和15.2%以及减卵亲率22.2%和12.2%[27]。

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陈红等应用于生物素内亲和技术找到血吸虫体表不存在rSj29蛋白,通过克隆传达后评估该蛋白的免疫系统维护效果,最后获得减虫率23.15%、肝脏减卵亲率18.6%和粪减卵亲率27..38%[28]。近期研究,有学者通过免疫系统蛋白组学和生物信息学技术,首次找到了30个低免疫反应的表格膜蛋白和10个AUC值相比之下小于0.90的抗原,特别是在认为STIP1具备很高的抗原性和免疫原性,这为下一阶段研究外用寄生虫药物和血吸虫疫苗获取了潜在的目标[29]。3血吸虫病疫苗研究面对的问题与未来发展长期以来,对于日本血吸虫病疫苗的研究,虽然人们早已找到了许多分子作为抗原候选分子,具备部分免疫系统维护效果,但至今仍并未取得一种需要有效地预防日本血吸虫病的疫苗,所以找寻可产生长年效用的血吸虫病疫苗,仍然是众多学者们努力奋斗的目标。为了前进血吸虫病疫苗研究工作,世界卫生组织热带病研究培训尤其规划署(WHOSpecialProgrammeforResearchanTraininginTropicalDiseases,TDR)将血吸虫病疫苗研制置放血吸虫病预防研究的优先地位。

我国也早已将日本血吸虫病基因工程疫苗项目已划入国家高技术计划范畴。   但,目前在血吸虫病疫苗研究领域中依然不存在问题:   ⑴抗原分子免疫系统维护力不低。科学家们曾以小鼠为模型对6种血吸虫病疫苗候选分子展开评估,结果都没超过40%或者更高的预期维护力[48],所以在疫苗的研究中,如何提升疫苗的免疫系统维护效果是关键点之一。

   ⑵免疫系统躲避现象。血吸虫免疫系统躲避机制有可能减少疫苗诱导的维护力水平或宿主产生的保护性免疫接收者。

日本血吸虫虫体表面不存在许多抗原分子,它往往不会融合宿主自身抗原,躲避宿主免疫系统的辨识。另外,疫苗免疫系统维护力的维持力必须时间和大量实验来证明。

   ⑶实验动物与人的免疫系统之间的差异。截至目前血吸虫病疫苗研究正处于动物模型实验的阶段,实验动物产生的免疫系统机制与人体差异相当大,而疫苗本身对于动物的不良反应还尚能不具体,所以造成实验动物得出结论的结论很难几乎限于于人体。

血吸虫病疫苗的研究任重而道远,有可能必须几代人的希望去逐步构建,过程很艰苦,但是科学家们不会竭尽全力。近几年,科学家们有了一些新的思路:(1)对新型疫苗候选抗原的检验。

HuWei等[49]针对日本血吸虫各种生活阶段的全基因组序列展开分析,取得了43707个传达序列标签(ESTs),共13131个基因种类。LiuFeng等[50]通过较为蛋白质组学和较为mRNA组学的方法,对日本血吸虫各发育阶段及卵壳、体被传达的蛋白展开较为分析、检验,取得3260个蛋白;近期研究,有学者通过免疫系统蛋白组学和生物信息学技术,首次找到了30个低免疫反应的表格膜蛋白和10个AUC值相比之下小于0.90的抗原,特别是在认为STIP1具备很高的抗原性和免疫原性,这为下一阶段研究外用寄生虫药物和血吸虫病疫苗获取了潜在的目标[51](2)多表位、多价疫苗或混合用于有所不同抗原疫苗,能协同发挥作用,针对有所不同虫期的抗原杀菌虫体,从而有效地提升疫苗的免疫系统维护效果[52];(3)新的疫苗寄送技术,如新的佐剂、纳米材料、脂质体等,佐剂的用于在疫苗免疫系统的过程中起着增进和提升免疫系统维护效果的起到,因此,自由选择必要的佐剂是不利于疫苗效果的提升;(4)强化对宿主免疫系统机制的研究。通过研究充份理解宿主病毒感染血吸虫后所引发的免疫反应,将不利于找到更佳的抗日本血吸虫病疫苗。


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