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浅析VIGS的作用机制

来源:华体会app下载   发布时间:2021-09-09 00:21nbsp;  点击量:

本文摘要:VIGS技术除在烟草(Gossele,等,2002)、番茄(张策等,2007)、豌豆(宋伟杰等,2007)和大豆(吕山花等,2010)等双子叶植物中应用于顺利外,许多单子叶植物病毒也被扩建成载体,以便在单子叶植物中诱导基因表达(Oikawa,2007)。

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VIGS技术除在烟草(Gossele,等,2002)、番茄(张策等,2007)、豌豆(宋伟杰等,2007)和大豆(吕山花等,2010)等双子叶植物中应用于顺利外,许多单子叶植物病毒也被扩建成载体,以便在单子叶植物中诱导基因表达(Oikawa,2007)。经过几年的发展,有数多种病毒载体在VIGS上顺利应用于,如烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)、马铃薯X病毒、番茄金色花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus,TGMV)、烟草质地瓣病毒(tobaccorattlevirus,TRV)、卫星病毒诱导的绝望系统(satellitevirus-inducedsilencingsystem,SVISS)、甘蓝缩叶病毒(cabbageleafcurlvirus,CbLCV)、玉米条纹病毒(maizestreakvirus,MSV)等(Burch-Smith等2004;王宏芝等,2005;Palmer等,1999)。大麦条纹花叶病毒(Lacomme等,2003)以及小麦矮小限病毒(wheatdwarfvirus,WDV)等(Matzeit等,1991)都早已用作基因绝望。

BSMV,由于其普遍的寄主范围(McKinneyandGreeley,1965)使其沦为单子叶宿主较好的RNA绝望载体(Holzberg等,2002)。这些载体的研发和利用为水稻和小麦等最重要单子叶作物功能基因组研究获取了有效地的工具。

最近,病毒感染单子叶植物的雀麦花叶病毒株Tall-fescue早已被改建用作VIGS,在最重要的谷稻类作物中应用于顺利(Ding等,2006)。在改进植物品质方面基因绝望技术被指出具备很大的应用于价值(Tang,2004)。

李加瑞等应用于RNA阻碍技术以Wx基因为靶基因很大地减少了小麦中直链淀粉的含量,而HarvinderS.等应用于VIGS技术以GBSS基因为靶基因也某种程度减少了小麦中直链淀粉的含量(HarvinderS.等2011)。Kusabs及同事堪称使用RNAi技术生产出能减少麦谷蛋白传达水平的稻米种类LGC-1(lowgluteincontent),给无法消化麦谷蛋白的肾脏病人带给福音。郭志鸿等(2008)使用RT-PCR技术分别克隆了马铃薯SBE1基因的片段SⅠ和SBE2基因片段SⅡ,并将SⅠ和SⅡ顺序相连获得融合片段SⅢ,建构了以SBE1基因和SBE2基因为靶标的RNA阻碍载体pRNAiⅢ,通过农杆菌细胞内法转化成马铃薯取得了表观直链淀粉含量介于59.31%~87.14%的转基因试管薯。

根据VIGS的起到机制,理论上引发目的基因绝望的大于放入片段为23个核苷酸(Bartel,2004),但在实际操作中23个核苷酸长度经常无法有效地启动目标基因绝望的再次发生,所以必须自由选择数倍于23nt的目标基因片段(Ekengren等2003;Ratcliff等1997)。但也无法过长(Thomas等,2001;JackieCampbell等,2010)。为了使目标基因需要有效地的绝望,有人回应研究的结果表明以200~500bp放入片段的绝望效果最佳(Burch-Smith等,2004;Ekengren等,2003;Lu等2003b)。当然,也有可能不存在其它影响绝望效果的因素,如目标基因序列的核苷酸构成(Thomas等2001)、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等(Khvorova等2003;Schwarz等,2003)。

如何有效地使病毒载体转至植物细胞,是病毒在植物体内拷贝与移往,以及再次发生目标基因绝望的关键。目前一般来说把含目标基因的病毒载体转至农杆菌中,然后通过农杆菌细胞内法病毒感染宿主植物。

然而,农杆菌细胞内法在单子叶植物中仍未顺利(姚丹青等,2009)。除此之外已发展了几种病毒选育方式,如牙签疫苗(Lu等2003a)、静脉注射渗入(Fu等2005)、高压喷气(Liu等2002a)及真空渗入(Ekengren等2003)等。

如果要在植物的局部区域取得有效地的绝望,静脉注射渗入技术较为理想(Fu等2005)。病毒的传播和植物的生长情况都会影响基因绝望的成功率,而环境有影响着病毒的传播和植物的生长情况(Burch-Smith等2004),其中温度对它们的影响仅次于。有所不同的VIGS载体在有所不同的植物中,引发高效基因绝望的温度也有所不同。

例如,用TRV病毒感染番茄,较好的绝望表型在22℃或更加较低的温度下再次发生;而用TRV病毒感染烟草,适合的温度则在25℃左右(Burch-Smith等,2004;Ekengren等,2003;Liu等,2002a;Nethra等,2006);25℃~29℃是BSMV在大麦上诱导基因绝望的适合温度。另外,Fu等(2006)找到,低温和低湿的条件可以强化基因绝望的强度和缩短绝望的持续时间。据张立荣(2011)等研究小麦VIGSPDS基因绝望效果较适温度在25℃~30℃。

Harvinder等(2011)研究表明,在小麦上实行基于BSMV的VIGS实验,最佳的温度条件是白天22℃/夜间18℃。温度的掌控可以用于生长箱来已完成。VIGS在检验功能基因组方面具备诸多优越性。

VIGS需要必要在当代植株绝望目的基因,不不存在传统方法中的诸多困难,目的基因缺陷的表型在当代就需要检验出来,这反映了VIGS较慢高通量的优点,具备最重要意义。另外,VIGS技术还需要构建核对有所不同品种间的基因绝望,研究基因功能。尽管VIGS具备诸多优越性,但VIGS也不存在一些容许。如VIGS有时有可能无法几乎诱导产生目标基因表达,残量低水平的mRNA依然有可能承托靶基因的功能,无法仔细观察到表型变异,其功能也难以确定;常常引发整个侵染植株上靶基因的不完全一致绝望,在植株间、实验间绝望水平也有可能有所不同;对于单子叶植物农杆菌细胞内法仍未顺利等(姚丹青等,2009)。

有些问题随着研究的了解是可以获得解决问题的,如可利用基因组序列和大量EST数据辅助设计VIGS载体的插入序列。VIGS效果是基于序列同源性,同源性越高,基因绝望效果就越好;可通过创建VIGS载体的内部阳性对照,用可见表型标记出有绝望的区域等方法来解决问题。另外,侵染的部位、次数等也可能会影响基因的绝望效果,这方面的研究尚待更进一步了解。目前为止,病毒载体的转染技术还没构成一套十分成熟期有效地的方法,有数的报导也只是在少数物种中获得成功,如烟草、番茄、拟南芥等,许多疫苗条件还必须更进一步优化,如病毒感染缓冲液的自由选择、病毒感染液浓度的确认以及疫苗方式的优化等。

所以,在实际应用于中,特别是在对于尚不VIGS研究报导的植物,展开前期VIGS体系优化试验对利用该技术手段研究基因在植物中的功能变得更为重要。大麦条斑花叶病毒有3条RNA链:α、β、γ,为短棒状病毒。小麦染病的症状为深绿和浅绿相间的点状条纹,而早期不会经常出现新的叶基部发黄红的条纹,同时预示株高减少,雌蕊育性减少,种子不圆润等。摩擦放可以使小麦病毒感染BSMV,但在自然界中BSMV主要以侵染种子及花粉传播的方式传播。

BSMV病毒可以在单倍体细胞中存活和交配。该载体的表达能力是Ti质粒载体的数倍。因其可以宿主Ti质粒无法侵染的单子叶经济作物如大麦、小麦、玉米、水稻等而被研究者顺位研发为工程载体。

此外BSMV载体享有较小的基因组,可以容纳较小的外源基因,这也是研究者们所青睐的一个优点。目前为止,BSMV-VIGS技术在小麦中的应用于早已有十年多的时间,BSMV载体主要应用于在小麦、大麦、燕麦、野生二粒小麦、簇毛麦、二穗短柄草等禾本科植物。

目前研究者们主要是改建BSMV的β,γ分子,其中以改建γ分子的报导为主。Holzberg等改建γb分子,首次构建BSMV-VIGS在大麦上应用于,Cheng等标记了BSMV的γb分子,使其具备了高通量克隆的特性。另外改建BSMV的β分子的VIGS系统也顺利应用于(Kawalek等)。

此外,Campbell等同时利β、γ分子放入有所不同的基因,在大麦上同时构建了两个基因的绝望。BSMV-VIGS研究的基因牵涉到了还包括植物生长发育、抗病虫、外用旱季、品质改进等过程。

另外,最近Bennypaul等等还通过建构PDS基因的BSMV重组载体研究VIGS的遗传性。Kawalek等利用BSMV-VIGS技术研究了与小麦凋亡有关的PLD基因的功能。Bennypaul等利用该技术构建了小麦根中COI1基因的绝望。BSMV-VIGS技术在小麦上研究与抗病虫涉及的基因功能方面是一个很有效地的工具,研究所牵涉到的基因还包括与抗条锈病有关的TaHLRG、PTaRtL和TaSBL基因(刘迪;TaSTK基因张宁宁;外用叶锈病有关的基因Lr21、RAR1、SGT1和HSP90Scofield等、TaRAR1基因张立荣;外用白粉病有关的基因Mlo基因Várallyay等、外用大麦黄矮病有关的TNBL1基因赵丹等及与抗蚜虫有关的基因WRKY53Van等等。

其中Várallyay等的研究中,同时绝望了PDS基因和Mlo基因,Van等的研究是首次利用VIGS技术研究小麦抗虫基因的报导。VIGS技术也可以研究与抗逆涉及的基因,如外用旱季威逼涉及的基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAMS、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因SAMDC和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因γ-ECS李昌澎[37]。在品质改进方面,Ma等[38]利用VIGS技术研究了与蛋白质及淀粉制备有关的基因HMW-GS1Bx14的功能。这也是首次利用BSMV-VIGS技术研究小麦穗子和籽粒中的基因功能的报导,对后来研究类似于基因的研究者来说很有糅合意义。

Bennypaul等[8]也通过建构放入GBSS基因片段的BSMV-VIGS载体,构建了小麦籽粒中GBSS基因的绝望,减少了籽粒淀粉中质量淀粉的含量。


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